TOPO克隆PCR产物的纯化与回收

1. PCR反应结束后，首先需通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，判断是否有目的大小的条带生成；
2. 推荐采用切胶回收法进行纯化，切胶时间最好控制在3分钟以内，避免紫外光对DNA的损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收的浓度，要求其浓度应≥30ng/μl，并通过跑胶确认仅存在目的条带。
3. 将目的片段连接至载体时，连接反应体系需按照说明书要求，投入各组分的体积不少于1μl。如果浓度过高，可先进行稀释；
4. 连接反应的温度可尝试设置为25°C或37°C，反应时间为5分钟。如果克隆结果不理想，可将时间延长至30分钟以获取更佳效果。

感受态细胞的转化与涂板

1. 对于连接产物的转化，推荐使用DH5α、Fast-T1等化学感受态细胞；
2. 感受态细胞不可反复冻融使用，-80°C下取出后建议一次性使用；
3. 重组产物与感受态细胞的体积比例为1:10，推荐将10μl重组产物加入到100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入到50μl感受态细胞中；
4. 热激处理需按照感受态细胞的说明书进行操作；
5. 平板抗生素抗性需与转化载体的抗性保持一致；
6. 涂板时，将菌液离心（2500×g，3分钟），使用移液枪吸取并丢弃多余的LB培养基，保留100μl重悬液后涂布全盘，或吸取适量进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 从平板中挑取适中大小的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落；
2. 挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析；
3. 将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，溶解混匀后取1-2μl作为PCR反应的模板（10/20μl体系）；
4. 推荐使用一对分别位于片段和载体上下游的引物进行PCR鉴定。

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