一、细胞培养条件

细胞名称：人结肠腺癌细胞LS1034
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：1640 + 10% FBS + 1% P/S
传代方法：建议第一次传代比例为1:2
备注：用无菌离心管收集瓶中培养基，以备用于过渡对比培养；若对比培养效果不理想，可直接购买利来国际的完整培养基。

二、细胞处理方法

收到细胞后，待培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，使用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，随后放于超净台内进行无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。

在显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的细胞照片保存（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片将作为售后依据，若未提供照片则默认收到状态良好。传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自制的完全培养基进行对比培养，换液时请确保瓶盖松弛。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞未达到80%汇合度，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基置于37℃、5% CO2孵箱中；若细胞密度超过80%，可进行传代，步骤如下：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞变化；若细胞大部分变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶，加入5ml以上完全培养基终止消化。
轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，然后转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞状态；待细胞回缩变圆时，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使其脱落，然后转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
弃去上清，沉淀细胞后加入1ml利来国际无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存；若需转入液氮罐，请在-80℃中保存24小时以上再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），立即放入37℃水浴中解冻至无结晶，随后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
弃去上清后，使用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃、5% CO2细胞培养箱培养。
第二天更换为新鲜完全培养基，继续培养。

四、注意事项

部分细胞贴壁较弱，运输过程中可能会出现细胞脱落的现象，这属于正常情况。如果脱落较多，建议将培养瓶内的培养液收集至离心管，并在1000 RPM下离心5分钟，收集上清作过渡培养。之后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打、重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止消化，再离心、弃上清、重悬后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶）。

五、售后条款

1）确认为可重发的情况及标准：
- 运输过程中发生各种问题（细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等）可申请重发；
- 细胞污染问题需在收到产品后48小时内提供真实实验结果，核实后可重发；
- 常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存的细胞复苏后24小时仍然显示大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可申请重发；
- 冻存细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时内未开封出现污染，可申请重发；
- 对于细胞活力问题，需在收到产品的7天内提供真实实验结果（建议使用台盼蓝染色法），核实后可重发；
- 收到细胞当天及第2,3天请拍照，对于3天内未告知的视为产品合格。若在4-7天内出现问题，并能提供收到细胞前三天和出现问题时的照片及详细操作步骤，经过技术人员判定责任可申请重发。

2）不予重发的情况：
- 客户造成的细胞污染；
- 客户不当操作导致细胞状态不佳；
- 非本库推荐的细胞培养体系导致的细胞状态不佳；
- 细胞状态不佳且未提供细胞培养前3天照片；
- 在培养过程中经过其他处理的细胞；
- 收到细胞后2天内未及时告知的情况；
- 其他视具体情况而定。